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流式細(xì)胞術(shù)是一種對溶液中單個細(xì)胞或顆粒進(jìn)行快速、多參數(shù)分析的技術(shù)。流式細(xì)胞儀利用激光作為光源，照射在細(xì)胞上，產(chǎn)生散射光和熒光信號，由檢測器如光電二極管或光電倍增管讀取。之后，這些信號被轉(zhuǎn)換成電子信號，由計算機(jī)進(jìn)行分析，并寫入標(biāo)準(zhǔn)格式(.fcs)數(shù)據(jù)文件。另外，細(xì)胞群可以根據(jù)其熒光或散射光的特性進(jìn)行分析或分選。

用于流式細(xì)胞術(shù)的儀器在過去的幾十年里不斷“進(jìn)化"著，以滿足越來越多的科研與臨床應(yīng)用需求。上海晶抗生物將為大家簡單介紹幾種流式細(xì)胞儀。

傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀

傳統(tǒng)的流式細(xì)胞儀由液流、光學(xué)和電子(檢測分析)三個系統(tǒng)組成。

液流系統(tǒng)

液流系統(tǒng)主要由鞘液(通常是一種緩沖鹽水溶液)構(gòu)成。在一定壓力下，鞘液將細(xì)胞或顆粒聚焦在一條直線，并將其輸送到激光攔截點。

光學(xué)系統(tǒng)

光學(xué)系統(tǒng)由激發(fā)光 (激光器)和收集光 (光電倍增管或PMTs和光電二極管)組成，產(chǎn)生用于分析樣品的散射光和熒光信號。一系列的雙色向濾光片可引導(dǎo)熒光到特定的探測器，以便每一個單獨的熒光色素可以被檢測和測量。更具體地說，雙色向濾光片只允許波長較短或較長的光通過，并以一定角度反射不能通過的光。例如，450雙色向長通濾光片(DLP)讓波長大于450 nm的光通過濾光片，并以一定角度反射較短波長的光，發(fā)送到另一個探測器。帶通濾光片只允許一定波長范圍內(nèi)的熒光通過。例如，450/50帶通濾光片只允許波長為450 +/- 25 nm的熒光通過。

電子系統(tǒng)

電子系統(tǒng)將探測器發(fā)出的信號轉(zhuǎn)換成可以被計算機(jī)讀取的數(shù)字信號。

常見的多激光系統(tǒng)通常有20個參數(shù)(FSC, SSC和18個熒光探測器)。目前，一些新的儀器正在引入5個或更多的激光器，并設(shè)置30-50個參數(shù)，但這并不常見。傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀使用的常見的激光是488nm(藍(lán)色)、405nm(紫色)、532nm(綠色)、552nm(綠色)、561 nm(綠)、640 nm(紅色)和355 nm(紫外線)，還有一些不常見的激光可用于特定用途。此外，還有一些儀器已經(jīng)用電子崩光電二極管(APD)取代光電倍增管(PMT)用于熒光檢測，目的是提高檢測的靈敏度。流式細(xì)胞儀系統(tǒng)組成示意圖

聲波聚焦流式細(xì)胞儀

聲波聚焦流式細(xì)胞儀可以使用超聲波更好地將細(xì)胞聚焦于一條直線，進(jìn)行激光照射。即使在較高的進(jìn)樣速度下，聲波聚焦技術(shù)也可以精確地將細(xì)胞定位在液流的中心，因此細(xì)胞信號的變異系數(shù)較小，數(shù)據(jù)質(zhì)量更高。作為對比，同樣在高進(jìn)樣速度下，傳統(tǒng)的流體動力學(xué)聚焦由于鞘液壓力相對變小，樣本流的中心部分變寬，導(dǎo)致信號變異系數(shù)增大、數(shù)據(jù)質(zhì)量下降。此外，聲波聚焦的方式允許更高的上樣量，并能夠減少樣品堵塞。聲波聚焦流式細(xì)胞儀可以利用多達(dá)4種激光和14個熒光通道對樣本進(jìn)行檢測。

聲波聚焦和流體動力學(xué)聚焦對比示意圖

細(xì)胞分選儀

細(xì)胞分選儀是傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀中的一種特殊類型，它允許用戶根據(jù)所需參數(shù)，選擇特定的細(xì)胞群或顆粒群，然后將這些細(xì)胞或顆粒引導(dǎo)到收集容器中，以供進(jìn)一步研究。

細(xì)胞分選儀對樣品液流進(jìn)行高頻振蕩，以產(chǎn)生液滴來分離細(xì)胞。然后，液滴被賦予正電荷或負(fù)電荷，并通過金屬偏轉(zhuǎn)板，在那里它們根據(jù)電荷被導(dǎo)向一個特定的收集容器。收集容器可以是管狀、載玻片或板狀(96孔或384孔較為常見)。

細(xì)胞分選儀有兩種類型，石英比色皿型和噴氣管型，它們的不同之處在于激光照射點的位置。石英比色皿型細(xì)胞分選儀具有固定的激光照射線路，更容易為分選做好準(zhǔn)備。噴氣管型細(xì)胞分選儀需要每天對激光照射線路進(jìn)行校準(zhǔn)，設(shè)置起來更困難，但更適合小顆粒檢測。

流式細(xì)胞分選儀

成像流式細(xì)胞儀

成像流式細(xì)胞儀(IFC)結(jié)合了傳統(tǒng)的流式細(xì)胞術(shù)和熒光顯微鏡系統(tǒng)，這允許在單細(xì)胞和群體細(xì)胞水平上快速分析樣品的形態(tài)和多參數(shù)熒光。IFC可以像共聚焦顯微鏡或熒光顯微鏡那樣跟蹤單個細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)分布，也可以像流式細(xì)胞儀那樣處理大量細(xì)胞。它們在多種應(yīng)用中發(fā)揮關(guān)鍵作用，如細(xì)胞信號傳導(dǎo)、共定位研究、細(xì)胞間相互作用、DNA損傷和修復(fù)，以及需要對大量細(xì)胞的細(xì)胞定位與熒光表達(dá)進(jìn)行協(xié)調(diào)的應(yīng)用。

質(zhì)譜流式細(xì)胞儀

質(zhì)譜流式細(xì)胞儀結(jié)合了飛行時間質(zhì)譜儀和流式細(xì)胞儀的功能。使用這種儀器時，細(xì)胞用重金屬離子標(biāo)記抗體進(jìn)行標(biāo)記，而不是熒光標(biāo)記抗體，并使用時間飛行質(zhì)譜法進(jìn)行檢測。但質(zhì)譜流式細(xì)胞儀不具備FSC或SSC光檢測功能，因此無法使用常規(guī)方法檢測細(xì)胞聚集體。此外，質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)不具有細(xì)胞自身熒光信號，試劑不具有與熒光標(biāo)記相關(guān)的發(fā)射光譜重疊，因此不需要補(bǔ)償。然而，樣品在分析過程中會被破壞，因此無法進(jìn)行細(xì)胞分選，并且采集速率遠(yuǎn)低于標(biāo)準(zhǔn)流式細(xì)胞儀。

用于微珠陣列分析的細(xì)胞儀

多重微珠陣列在分析小體積樣品中的大量分析物方面已變得流行。簡單地說，這些檢測利用在特定通道中具有已知熒光量的捕獲珠和由單獨的激光檢測到的報告分子，來量化與特定珠相關(guān)的捕獲分析物的數(shù)量。

光譜流式細(xì)胞儀

多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)的挑戰(zhàn)之一是熒光色素之間的補(bǔ)償(或消除光譜重疊)。一種新型的流式細(xì)胞儀，光譜分析儀就是專門針對這一問題而設(shè)計的。光譜分析儀測量多色樣品中每個熒光色素的整個熒光發(fā)射光譜，以創(chuàng)建光譜指紋。然后在分析過程中，每個光譜是未混合的，為每個熒光色素提供一個純信號。光譜分析正逐漸取代傳統(tǒng)的PMTs作為高維流式細(xì)胞術(shù)的檢測方法。

納米型流式細(xì)胞儀

納米型流式細(xì)胞儀覆蓋了傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀 200nm 以下粒徑顆粒的檢測盲區(qū)，可檢測納米顆粒以及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，細(xì)菌，病毒，細(xì)胞外囊泡（外泌體）等，對它們的粒徑、分布、顆粒濃度以及生物化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行高分辨、高選擇性、高通量的檢測。